Polybrene(10mg/mL)

CatalogNumber：LE110

01/Polybrene聚凝胺LE110產(chǎn)品概述

　　Polybrene（聚凝胺，hexadimethrinebromide）是一種多聚陽離子聚合物，廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，是一種常用的促感染試劑，能夠顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率，其作用機理可能是通過中和細(xì)胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進(jìn)吸附作用。同時，Polybrene也常用于哺乳動物細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染實驗以增強脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。Polybrene也是一種有名的抗肝素劑（肝素拮抗劑），常用來生產(chǎn)非特異性凝集的紅細(xì)胞。它還參與到低分子量DNA的轉(zhuǎn)化中。此外，Polybrene也多用于蛋白測序，因為小劑量的Polybrene在自動測序分析可明顯改善多肽的降解現(xiàn)象。PVDF膜加入polybrene還能提高膜的親和性。

本產(chǎn)品以溶液形式提供，粉末用0.9%NaCl配制成10mg/mL的溶液，并用0.22μm濾膜過濾除菌。使用時一般按1:1000-1:5000稀釋，依細(xì)胞種類不同稀釋比例不同，具體使用濃度請查閱相關(guān)文獻(xiàn)。

02/產(chǎn)品組分

03/Polybrene 聚凝胺 10mg/mL 保存條件：冰袋（wetice）運輸。-20℃保存，有效期24個月。建議分裝保存，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點

　　即用型試劑，無需進(jìn)行試劑配置，簡單方便。

　　無菌制劑，可直接加入細(xì)胞使用。

05/Polybrene聚凝胺LE110實驗步驟

　　慢病毒感染（LentiviralInfection）實驗步驟如下：

　　1.包裝慢病毒并測定慢病毒滴度，通過病毒滴度和MOI計算目的細(xì)胞感染所需的病毒量。

　　2.實驗前一天，將生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞消化計數(shù)后稀釋至1-3×105/mL，加入12孔板，1mL/孔。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　?懸浮細(xì)胞不需要提前一天接種，實驗前將細(xì)胞計數(shù)接種后，直接加入病毒混合液即可。

　　3.配制慢病毒+polybrene+培養(yǎng)基混合液。polybrene一般使用濃度為2-10μg/mL，但對某些細(xì)胞（如末端分化的神經(jīng)元，DC細(xì)胞等）毒性較大，初次使用建議先做毒性測試。

　　4.吸去12孔板中目的細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入3中配制的慢病毒混合液，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

　　?感染懸浮細(xì)胞或半懸浮細(xì)胞，則需采用平角離心轉(zhuǎn)染法，即將適量的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)板后，封好口，放入平角離心機中，低速（200xg）離心?1h?，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

　　?若實驗條件有限，沒有平角離心機，可用離心管代替，將細(xì)胞吸入離心管中，進(jìn)行低速離心，去掉大部分上清，加入適量的病毒液，室溫放置?15min，然后將細(xì)胞和病毒液同時吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

　　5.病毒感染16h后更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

　　6.病毒感染36-48h后，可加入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株篩選，或采用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、westernblot、qPCR等方法檢測目的基因表達(dá)情況。

06/適用范圍

　　Polybrene目前廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，是一種常用的促感染試劑，能夠顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率。

07/注意事項

　　1.Polybrene聚凝胺10mg/mL對某些細(xì)胞（如末端分化的神經(jīng)元、DC細(xì)胞）毒性較大，初次應(yīng)用建議先做毒性測試。

　　2.本說明書中提供的Polybrene聚凝胺10mg/mL使用濃度范圍僅供參考，具體使用濃度請參考相關(guān)文獻(xiàn)。

　　3.為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗。

　　4.所有慢病毒操作均需在生物安全柜(BSL2級)中進(jìn)行。

　　5.本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

08/Polybrene 聚凝胺 10mg/mL實驗案例分析

　　1.提前一天使用10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStarsLentivirusPackagingCellLine（CL110001），待細(xì)胞密度為75%左右開始包裝慢病毒。

　　2.使用ViralStarsLPLentivirusPackagingKit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝。取10μL慢病毒包裝輔助質(zhì)?；旌衔铮≒ackagePlasmidMix）加入到2mL離心管中，加入2.5μL表達(dá)GFP的對照質(zhì)粒（ControlPlasmid），輕輕混合，加入32μLPolyShooter轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；旌?，室溫孵育3分鐘。

　　3.往上述混合物中加入1.8mL無血清無雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　4.將上述1.8mL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物輕輕地逐滴均勻加入10cm皿慢病毒包裝細(xì)胞中，輕輕搖動培養(yǎng)皿混勻，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒。

　　5.轉(zhuǎn)染24h后，棄去初始病毒上清液，加入10mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

　　6.轉(zhuǎn)染48h后，收集病毒上清液，再加入10mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

　　7.轉(zhuǎn)染72h后，進(jìn)行二次病毒上清液收集，與48h收集的上清液混合后，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，0.22μm濾器過濾，使用ViralStarsLCLentivirusConcentrationSolution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進(jìn)行20倍濃縮，使用1mLViralStarsLSLentivirusStorageSolution（LS110R）重懸慢病毒顆粒。

　　8.使用上述制備的慢病毒感染目的細(xì)胞HEK293T，設(shè)置兩組實驗組:(1)病毒+polybrene(10μg/mL)+培養(yǎng)基混合液，(2)病毒+培養(yǎng)基混合液(不添加polybrene)。

　　9.使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，并拍照記錄。使用流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計GFP陽性細(xì)胞數(shù)，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2:慢病毒(GFP)感染目的細(xì)胞HEK293T的過程中是否添加polybrene(10μg/mL)的感染效率對比實驗。

09/其他相關(guān)產(chǎn)品